腺病毒或桿狀病毒輔助基因之非限制性實例包括(但不限於)E1A、E1B、E2A、E4及VA，其可向AAV包裝提供輔助功能。 可用於蛋白生產的許多桿狀病毒菌株及變異體及對應容許的昆蟲宿主細胞描述於Luckow等人、Miller等人；Maeda等人及McKenna中。 為了產生AAV Proto 7載體，FVIII內含子之34個鹼基藉由Proto 5載體中呈反向之34鹼基人類ApoE/C1增強子之第二複本置換。 Proto 7之序列之核苷酸序列闡述於SEQ ID NO：8中。
- 在一些實施例中，編碼Cas蛋白質之核酸及編碼至少一至兩種核糖核酸之核酸經由病毒轉導(例如慢病毒轉導)引入至細胞中。
- 在一些實施例中，用於分化之表面包含一或多種細胞外基質蛋白。
- 在第二態樣中，本發明之重組AAV載體包含Proto 1S，其示意性地描繪於圖2B中，且包含SEQ ID NO：2中所闡述之核酸序列。
- 在小鼠及猴研究中評估PD終點(血漿FVIII-SQ蛋白及活性、肝臟DNA載體基因組及RNA轉錄複本)。
- 當您小孩到期接種下一劑疫苗時，我們將透過短訊或電郵發出另一個預約邀請。
- 本發明技術考慮出於任何目的改變細胞中之目標多核苷酸序列。
- 自分化第1天至第7天，亦向分化培養基中添加2 µM嘌嗎啡胺及100 ng/ml FGF8。
在確定數值是否接近或近似特定敘述之數值時，接近或近似未敘述之數值可為在呈現之上下文中提供特定敘述之數值的實質性等效物的數值。 如本文所用，術語「神經病症」或「神經病況」被定義為影響中樞神經系統、周邊神經系統或兩者，包括其任何細胞或組織之病症或病況。 在許多實施例中，該經分離神經細胞在移植至患者之中樞或周邊神經系統中時逃避免疫識別。
分子治療: 核酸医薬
隨後，序列比較演算法基於所指定之程式參數計算一或多個測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。 在一些實施例中，本文所描述之改變或修飾引起目標或經選定多核苷酸序列之表現減少。 在一些實施例中，本文所描述之改變或修飾引起目標或經選定多肽序列之表現減少。
- 實例5 評估Rag2小鼠中之構築體 使用圖1之FVIII載體、Proto 1、Proto 1S、Proto 2S及Proto 3S構築體，使用桿狀病毒及293細胞產生包含密碼子優化SQ FVIII編碼基因序列之AAV病毒粒子。
- 多巴胺神經元先驅細胞及神經母細胞係藉由熟習此項技術者公認之任何方法自NHP iPSC分化。
- 此研究之目標為評估相比於野生型小鼠(C57BL/6J)，在雄性Rag2-/-x FVIII-/-小鼠中單次劑量之AAV5-FVIII-SQ之後8週的出血時間之功能性凝血終點。
- 此方法之優點為細胞為可選的且適合於大規模產生重組AAV。
在進一步減小AAV FVIII載體之尺寸及/或增加來自AAV載體之FVIII轉殖基因之表現的嘗試中，本發明亦提供編碼B域及a3域缺失之FVIII的完全包裝、較小(即小於5.0kb)AAV載體。 本發明亦關於包含治療有效量之用於治療罹患A型血友病之個體之重組AAV 分子治療 FVIII病毒的組合物，其中個體之血清中不存在抗AAV衣殼抗體。 本發明亦關於治療有效量之重組AAV FVIII病毒用於製備用以治療罹患A型血友病之個體之藥物的用途，其中個體之血清中不存在抗AAV衣殼抗體。 [圖5]描繪移植至健康免疫功能不全SCID-灰棕色小鼠腦部之紋狀體中的野生型小鼠iPSC衍生之內皮細胞的生物發光成像。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
在一些實施例中，在該患者經歷繼發於神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期功能。 在其他實施例中，該患者之血腦障壁之該後續破壞係歸因於感染或中風。 在許多實施例中，該神經細胞群在該患者之血腦障壁之破壞後展現出長期存活。 在多個實施例中，該神經細胞群在該患者之血腦障壁之該破壞後展現出長期功能。
圖6表明本發明之各種重組AAV FVIII構築體誘導FVIII蛋白之活體內表現，其如在小鼠尾端靜脈流體動力學注射分析中量測。 在第三十七態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：44中所闡述之核酸序列之構築體106AT。 在第三十六態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：43中所闡述之核酸序列之構築體106。
分子治療: Taxes and tax credits
在另一實施例中，本發明提供本發明之AAV載體或本發明之重組AAV病毒粒子中的任一者用於製備供治療A型血友病用之藥物之用途。 在一態樣中，藥物包含有效治療A型血友病之量的一定量表現人類FVIII之AAV載體或重組AAV FVIII病毒粒子。 分子治療 本發明亦提供本發明之用途中的任一者，其中在投予藥物之後，測定個體之血清中不存在或存在抗AAV衣殼抗體。
在一些實施例中，AAV cap基因編碼具有來源於特定AAV血清型，例如表1中示出的血清型之胺基酸序列的衣殼蛋白。 在另一實施例中，本發明提供包含用於治療A型血友病之本發明之AAV載體或重組AAV病毒粒子中的任一者之組合物。 在一態樣中，組合物包含有效治療A型血友病之量的一定量表現人類FVIII之AAV載體或重組AAV病毒粒子。 另外，本發明之組合物中的任一者與有效量的皮質類固醇一起在個體中投予，所述個體在投予組合物之後測定為在血清中具有抗 AAV衣殼抗體。
分子治療: 接種疫苗
用作載體之病毒一般為苜蓿銀紋夜蛾多衣殼核型多角體病毒家蠶(Kato等人，2010)。 「AAV病毒粒子(AAV virion/AAV viralparticle)」或「AAV載體粒子」係指由至少一個AAV衣殼蛋白及衣殼化聚核苷酸AAV載體組成之病毒粒子。 圖5提供Rag2小鼠中之重組AAV FVIII Proto構築體之評估的結果，且表明Proto病毒構築體與圖1中示出的載體類似地轉導FVIII，其中y軸表示藉由ELISA分析測定之FVIII蛋白之ng/ml。 本發明亦關於治療罹患A型血友病之個體之方法，其包含以下步驟：向所述個體投予治療有效量之重組AAV FVIII病毒，及在投予所述治療有效量之所述重組AAV FVIII病毒之後，測定所述個體之血清中不存在 或存在抗AAV衣殼抗體。 在一個實施例中，方法進一步包含在進行個體之血清中存在抗AAV衣殼抗體之測定之後向所述個體投予有效量的皮質類固醇之步驟。
在人類中，存在兩種MHC：I類及II類，「HLA-I」及「HLA-II」。 HLA-I包括三種蛋白質：HLA-A、HLA-B及HLA-C，其呈現來自細胞內部之肽，且由HLA-I複合體呈現之抗原吸引殺手T細胞(亦稱為CD8+ T細胞或細胞毒性T細胞)。 HLA-II包括五種蛋白質：HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOB、HLA-DQ及HLA-DR，其將來自細胞外部之抗原呈現至T淋巴細胞。 應理解，「MHC」或「HLA」之使用不意欲為限制性的，因為其視基因係來自人類抑或鼠類而定。 因此，由於其關於哺乳動物細胞，此等術語可在本文中互換使用。 通常，「載體構築體」、「表現載體」及「基因轉移載體」意謂能夠引導相關基因之表現且可將基因序列轉移至目標細胞之任何核酸構築體。
分子治療: 疫苗安全
可用於本發明之重組AAV FVIII調配物中之另一緩衝劑為單水合一元磷酸鈉，其在一些實施例中以約0.1mg/ml至約3mg/ml、約0.5mg/ml至約2.5mg/ml、約1mg/ml至約2mg/ml、或約1.3mg/ml至約1.5mg/ml之濃度可用。 在一個尤佳實施例中，本發明之AAV FVIII調配物包含約1.38mg/ml單水合一元磷酸鈉。 在更尤佳本發明實施例中，本發明之重組AAV FVIII調配物包含約1.42mg/ml二元磷酸鈉及約1.38mg/ml單水合一元磷酸鈉。 在本發明之另一態樣中，亦藉由允許複製AAV或產生生物產品，且可維持於培養物中之任何哺乳動物細胞類型進行本發明之方法。 使用的較佳哺乳動物細胞可為HEK293、HeLa、CHO、NS0、SP2/0、PER.C6、Vero、RD、BHK、HT 1080、A549、Cos-7、ARPE-19及MRC-5細胞。 在一些實施例中，輔助功能由包含腺病毒或桿狀病毒輔助基因之一或多種輔助質體或輔助病毒提供。
某些實施例包括包含可操作地連接於至少一種調節序列之編碼變異多肽之核苷酸序列的表現載體。 分子治療 用於本文中之調節序列包括啟動子、強化子及其他表現控制元件。 在某些實施例中，表現載體針對待轉化之宿主細胞之選擇、欲表現之特定變異多肽、載體之複本數、控制該複本數之能力或由載體編碼之任何其他蛋白質，諸如抗生素標記之表現進行設計。 如本文所用，術語「外源」欲意謂所提及之分子或所提及之多肽係被引入至相關細胞中的。 多肽可例如藉由將編碼核酸引入至細胞之基因材料中，諸如藉由整合至染色體中，或作為非染色體基因材料，諸如質體或表現載體引入。
分子治療: 疫苗超級英雄漫畫
未在存活猴中觀測到肝臟臨床化學之AAV5-FVIII-SQ相關變化，指示未觀測到肝功能障礙。 在形成抗FVIII抗體之動物中觀測到可能的AAV5-FVIII-SQ相關APTT延長。 未觀測到肝臟臨床化學之AAV5-FVIII-SQ相關變化，指示未觀測到肝功能障礙。 此研究之目標為在以單次靜脈內團式注射形式給予食蟹獼猴時，經8週藉由FVIII-SQ轉殖基因評估兩個衣殼(AAV5.2 FVIII-SQ及AAV8.2 FVIII-SQ，即分別地AAV5及AAV8衣殼蛋白，及AAV2 ITR)之相對活性。 分子治療 八隻雄性食蟹獼猴在研究起始時為2.8至4.1歲且稱重為2.6與3.6kg之間。 所有動物關於相比於免疫耗盡食蟹獼猴血清之抗AAV5或抗AAV8轉導抑制活性進行預篩選。
[圖4]描繪移植至健康同種異體BALB/c小鼠腦部之紋狀體中之野生型EC的生物發光成像。 當動物失去意識時，記錄其重量且將動物頭頂自眼睛高度刮毛至耳後。 在中風小鼠模型-局部腦缺血小鼠模型中評估根據上述方法生成之內皮細胞。 在一些情況下，經由腦實質內、腦室內或鞘內(例如，腦池或腰椎)投與來注射該等細胞。
分子治療: 疫苗安全
反向末端重複序列側 接用於非結構複製蛋白及結構蛋白之獨特編碼核苷酸序列。 分子治療 末端145nt為自互補的且經組織以使得可形成形成T形髮夾之能量穩定分子內雙螺旋。 此等髮夾結構充當病毒DNA複製來源，充當細胞DNA聚合酶複合之引物。
術語「個體」及「個體」在本文中可互換地使用，且係指動物，例如可獲得細胞之人類及/或向其用如本文所描述之細胞提供治療，包括預防性治療之人類。 對於特定動物(諸如人類個體)特有之感染、病況或疾病狀態之治療，術語個體係指該特定動物。 分子治療 如本文中可互換使用之「非人類動物」及「非人類哺乳動物」包括哺乳動物，諸如大鼠、小鼠、兔、羊、貓、狗、牛、豬及非人類靈長類動物。 術語「個體」亦涵蓋任何脊椎動物，包括但不限於哺乳動物、爬蟲、兩棲動物及魚。 然而，有利地，個體為哺乳動物，諸如人類，或其他哺乳動物，諸如家養哺乳動物，例如狗、貓、馬及其類似動物，或生產哺乳動物，例如牛、羊、豬及其類似動物。
分子治療: 核酸医薬
如本文所用，「免疫抑制因子」或「免疫調節因子」或「致耐受性因子」包括低免疫因子、補體抑制因子及其他因子，該等因子在投與、移植或植入後調節或影響細胞受宿主或接受個體之免疫系統識別的能力。 分子治療 在一些實施例中，在該患者經歷繼發於該神經病症或病況之該患者之血腦障壁的後續破壞之後，該神經細胞群在該患者中維持長期功能。 在一些實施例中，該投與包含將該神經細胞群移植至該患者之中樞或周邊神經系統中。 在某些實施例中，該移植包含將該神經細胞群注射至該患者中。
分子治療: Taxes and tax credits
類似地，術語在關於編碼核酸之表現使用時係指細胞內所含有且並非外源地引入之編碼核酸之表現。 術語「以可操作方式連接」或「可操作地連接」關於兩個或更多個組件(諸如序列元件)之並接可互換使用，其中該等組件經配置以使得兩個組件均正常地起作用，且允許該等組件中之至少一者可介導施加於其他組件中之至少一者上之功能之可能性。 以說明之方式，若轉錄調節序列反應於一或多種轉錄調節因子之存在或不存在而控制編碼序列之轉錄量，則諸如啟動子之轉錄調節序列以可操作方式連接於編碼序列。 轉錄調節序列通常以順式與編碼序列以可操作方式連接，但不必直接與其相鄰。 舉例而言，強化子為以可操作方式連接於編碼序列之轉錄調節序列，儘管其並不鄰接。
分子治療: 免疫系統嚴重或中度受損兒童接種第三劑疫苗的資格
在動物模型及人類患者中均存在大量證據表明，神經細胞移植為一種在科學上可行且在臨床上有前景之治療神經病症及病況之方法。 如請求項43之用途，其中投予所述藥物導致所述個體中至少約1 IU/dl 功能因子VIII蛋白之表現。 此研究之次要目標為描述全身性投予重組FVIII AAV病毒後，對FVIII轉殖基因及/或AAV衣殼蛋白之免疫反應，評估FVIII AAV投配對研究期間的FVIII置換療法頻率之影響，及評估投配對研究期間需要治療之出血事件數目的影響。 1/2期人類臨床試驗之所提出起始劑量6E12 vg/kg AAV5-FVIII-SQ係基於亦在猴及小鼠中具有可偵測血漿FVIII-SQ蛋白及活性水準之10倍安全係數選擇，降低治療 不佳結果之可能性。
分子治療: 疫苗超級英雄漫畫
在另一實施例中，本發明提供治療罹患A型血友病之患者之方法，其包含向患者投予治療有效量之本發明之AAV載體中的任一者，或本發明之病毒粒子或由本發明之方法生產之病毒粒子。 在第十四態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：22中所闡述之核酸序列之構築體因子VIII-BMN001。 在第十三態樣中，本發明之重組AAV載體包含SEQ ID NO：21中所闡述之核酸序列之構築體100ATG短polyA 2× μ-球蛋白增強子。 在第十二態樣中，本發明之重組AAV載體包含含SEQ ID NO：20中所 闡述之核酸序列之構築體2× SerpinA hAAT ATG FVIII 2× μ-球蛋白增強子。
在一些實施例中，經由病毒轉導(例如慢病毒轉導)將多核苷酸引入細胞中。 在一些實施例中，編碼Cas蛋白質之核酸及編碼至少一至兩種核糖核酸之核酸經由病毒轉導(例如慢病毒轉導)引入至細胞中。 在一些實施例中，Cas蛋白質由如本文所描述之經修飾核酸(例如，合成經修飾mRNA)編碼。 在某些態樣中，本發明技術藉由靶向及調節(例如，減少或消除)II類反式活化因子表現來調節(例如，減少或消除)MHC II基因之表現。 CIITA為蛋白質之LR或核苷酸結合域富白胺酸重複家族之成員，且藉由與MHC強化體結合來調節MHC II之轉錄。 在一些實施例中，為確定神經膠質細胞呈現細胞特異性特徵及特點，可將細胞移植至動物模型中。
一種自幹細胞活體外分化之神經元，該神經元表現外源性CD24多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 一種自幹細胞活體外分化之神經細胞，該神經細胞表現外源性CD24多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 一種自幹細胞活體外分化之神經元，該神經元表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經元展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 一種自幹細胞活體外分化之神經細胞，該神經細胞表現外源性CD47多肽且表現：i)降低表現量之MHC I類及/或II類人類白血球抗原及/或ii)降低表現量之B2M及/或CIITA，其中該神經細胞展現降低之小神經膠質細胞吞噬作用。 一種用於抑制患者體內投與之神經細胞群之小神經膠質細胞吞噬作用的方法，其包含向該患者投與治療有效量之神經細胞群，該神經細胞群包含外源性CD47多肽及表現減少之MHC I類及/或MHC II類人類白血球抗原。
多個出血事件之結果為產生促進衰弱多關節關節病且大大增加死亡風險之潛在病理學。 FVIII(例如FVIII-Fc融合蛋白)之化學修飾(例如聚乙二醇聚合物之直接結合)及生物工程改造提高半衰期大致50%，且因此在減少之投藥及將活性水準維持於高於1%谷值中展現前景。 然而，此等較長效FVIII仍依賴於多次輸注以維持重度HA患者 中之FVIII活性之臨界水準。 因此存在完全預防性治療HA以給予患者與正常及不出血生活相容的FVIII水準的強烈未滿足需要。 投予本發明之AAV FVIII病毒可在一些情況下導致可觀測程度的肝毒性。 肝毒性可藉由多種熟知且慣例地使用之技術量測，例如在AAV FVIII投予之前(亦即基線)及AAV 分子治療 FVIII投予之後量測個體血流中之某些肝臟相關酶(例如丙胺酸轉胺酶，ALT)之濃度。
分子治療: 核酸医薬
在某些實施例中，調配物中之重組AAV FVIII病毒粒子之濃度可在1E12 vg/ml至2E14 vg/ml範圍內。 在一個尤佳實施例中，調配物中之重組AAV FVIII病毒粒子之濃度為約2E13 vg/ml。 在另一較佳實施例中，存在於調配物中之重組AAV FVIII病毒粒子為AAV5-FVIII-SQ，其來源於AAV5衣殼中之示意性地顯示於圖2A中之Proto 1載體之衣殼化。 如本文所用之「AAV載體」係指包含一或多種藉由AAV末端重複序列側接且可操作地連接於一或多種表現控制元件之所關注的聚核苷酸(或轉殖基因)之載體。 此類AAV載體可複製及包裝至已經編碼及表現rep及cap基因產物之載體轉染的宿主細胞中之感染性病毒粒子(若存在)中。 「轉錄調節元件」參與基因轉錄調節之基因之核苷酸序列，包括啟動子加上反應元件、活化子及增強子序列(用於結合轉錄因子以輔助RNA聚合酶結合及促進表現)及操縱子或靜止子序列(抑制因子蛋白結合以阻斷RNA聚合酶附接及預防表現)。