以2μM的样品浓度，将多种重组突变体样品与体外培养的人乳腺癌细胞Bcap细胞共孵育12h，采用激光共聚焦技术分析、观察各突变体的穿膜效率。 将扩增片段采用DNA片段回收试剂盒纯化，并以Bam HI和Xho I双酶切，回收片段。同时以BamHI和XhoI双酶切TCS-HBD-pET28b载体质粒，回收载体片段。并用T4DNA连接酶进行连接。转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。。 采用DNA人工固相合成方法合成两端带Bam HI和Xho I酶切位点的DNA序列，该序列经过密码子优化，编码穿膜肽TAT。 将此人工合成DNA片段插入到已用Bam HI+Xho I双酶切的EGFP-ELBD-HBD-pET28a表达载体中，转化E.coli DH5α菌株，37℃过夜培养15h，质粒DNA回收试剂盒纯化重组质粒DNA，送DNA序列测序公司测序验证。 本发明包括编码本发明所述“肿瘤靶向肽”或肿瘤细胞靶向性穿膜肽或含其的融合蛋白的DNA以及含有这些DNA的载体、转化体。 “肿瘤细胞靶向性穿膜肽”为是指一类短肽序列，含有具有细胞穿膜肽活性的CPPs结构域和上述“肿瘤靶向肽”。
本申请描述了重组病毒载体的构建，与所述载体相关的方法和它们在肿瘤细胞系、动物模型及癌症患者中的用途。 一种所述肿瘤靶向多肽的制备方法，其包含培养权利要求26-27中之一所述宿主细胞，制备所述肿瘤靶向多肽。 副甲状腺癌 如权利要求15所述的缀合物，其特征在于所述细胞穿膜肽为SEQ ID NO.12氨基酸序列所示的多肽，来自HIV的反式激活蛋白TAT的氨基酸片段，EC-SOD来源的肝素结合域的氨基酸片段，HBEGF来源的肝素结合域的氨基酸片段，或它们的衍生物。 为了有效地分离纯化或分泌目标蛋白，常常还可利用便于分离纯化的标签蛋白或标签多肽。 常用的有谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)、六聚组氨酸肽(His.Tag)、蛋白质A和纤维素结合位点等。
副甲状腺癌: 副甲状腺腫瘍とは
可以选择能调节插入的基因序列的表达，或能按照所需的特殊方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。 在某些诱导物的存在下，某些启动子启动的表达会升高；因此，可以控制经基因改造的多肽的表达。 另外，不同宿主细胞具有特征性的和特殊的翻译、翻译后加工和修饰(如磷酸化、裂解)蛋白质的机制。 可以选择适当的细胞系以确保对表达的外源蛋白质进行合乎需要的修饰和加工。 溶瘤性的细胞死亡允许免疫系统获得识别和杀死肿瘤细胞的能力。
在过去的几十年中已经开发了病毒载体的所有这些特性并且在生物医学中广泛地研究了例如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。 如权利要求12所述的缀合物，其特征在于所述治疗成分包含放射性治疗成分，化学治疗成分，抗体，酶，或它们的组合。 一种肿瘤靶向多肽，其包含氨基酸序列为YXGXR所示的第一序列和氨基酸序列为YXGXR所示的另一第二序列，所述第一序列与所述第二序列之间通过连接肽链接，其中Y表示酪氨酸或其衍生物；G表示甘氨酸或其衍生物；R表示精氨酸或其衍生物；X表示含侧链带脂肪类基团或/和羟基类基团或它们组合或其衍生物的氨基酸。
副甲状腺癌: 患者さん向け
现已发现有多种表皮生长因子类配体分子能与EGFR特异性的结合并发挥生物学效应。 这些配体分子包括表皮生长因子，转化生长因子(TGF-α)，双调蛋白(amphireguin，AR)、B-细胞素(beta-celluin，BTC)、肝素结合样表皮生长因子(HB-EGF)、表皮素(epiregulin，EPR)以及痘苗病毒来源的痘苗病毒生长因子等。 32.根据权利要求19-31中任一项的用途或方法，其中所述方法还包括施用能够下调受试者中的调节性T细胞的物质。 31.根据权利要求19-30中任一项的用途或方法，其中所述方法还包括施用化学疗法或抗CD20治疗或其它用于阻断中和抗体的方法。 11.根据权利要求10的溶瘤性腺病毒载体，其中所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体，将整联蛋白结合（RGD)区和/或结合硫酸肝素的聚赖氨酸修饰插入纤毛中。
- 腺病毒在施用之后相对短的时间内从身体中被清除出去；因此，刺激免疫系统以能够识别特异性的肿瘤抗原有关键的重要性，从而所述治疗对于患者可引起持续的有益效果。
- 适合的外源治疗性基因包括但不限于免疫治疗性基因、抗血管生成性基因、化学保护性基因和“自杀”基因，并且可利用经修饰的病毒载体或非病毒方法（包括电穿孔、基因枪和脂质或聚合物包被）将它们引入细胞。
- 此外，所述组合物可包含至少两种、三种或四种不同的本发明的载体。
- 本发明的目的是提供用于实现腺病毒的上述特性的新的方法和手段，并从而解决常规癌症疗法的问题。
- 24.根据权利要求19-23中任一项的用途或方法，其中在治疗期间施用溶瘤性腺病毒载体或药物组合物数次。
- 治疗期间的长度可变化，例如可持续2-12个月或更长。
- “药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
- 此类减少T抑制因子或调节性T 细胞的试剂可选自：抗CD25抗体或化疗剂。
另一方面，本发明公开了本发明所述肿瘤靶向多肽的制备方法，其包含培养本发明所述宿主细胞，制备所述肿瘤靶向多肽。 在一些实施方式中，所述肿瘤靶向多肽为氨基酸序列为SEQ ID NO.1-4或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9中之一的多肽或其修饰衍生物；优选为如氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9的多肽。 在一些实施方式中，所述连接肽包含形成α-螺旋的氨基酸序列，优选为所述连接肽包含刚性α-螺旋的结构，更优选所述连接肽包含氨基酸序列为HMAATT的序列。 背景技术 肿瘤是当今世界严重影响人类健康和生命的三大疾病之一。 在许多常见的肿瘤疾病中，如乳腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌、表皮鳞癌、肾癌、头颈部恶性肿瘤、恶性胶质瘤等，往往都存在肿瘤细胞表面表皮生长因子受体异常过度表达的现象1，并且EGFR的高表达常常与细胞增殖活动异常密切相关。 在每个正常人体细胞的表面的EGFR的数量通常为4×104到1×105左右，而每个肿瘤细胞表面的EGFR则超过2×106，是正常细胞的20-50倍2。
副甲状腺癌: 分子標的薬治療
本发明的溶瘤性腺病毒载体诱导病毒粒子介导的对肿瘤细胞的溶瘤作用并活化抗肿瘤细胞的人免疫应答。 在本发明的优选实施方式中，所述方法或用途还包括施用能够下调受试者中的调节性T细胞的物质。 “能够下调调节性T细胞的物质”指减少被鉴别为T 抑制因子或调节性T细胞的细胞的量的试剂。
装备病毒的一个目标是诱导针对允许病毒复制的细胞的免疫反应。 单独的病毒复制虽然是免疫原性的，但是通常不足以诱导有效的抗肿瘤免疫性。 为了强化对治疗性免疫性的诱导，可用激发性蛋白（例如细胞因子）装备病毒，用于促进将肿瘤抗原引入抗原呈递细胞（例如树突细胞），以及用于它们的激发和/或成熟。 将免疫治疗性基因引入肿瘤细胞中以及蛋白质的翻译，导致免疫应答的活化和有效地破坏肿瘤细胞。 在这方面最相关的免疫细胞是天然杀伤细胞（NK)和细胞毒性⑶8+T细胞。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌の診断
这些细胞被鉴别为含有下列免疫表现型标志物的一种或多种：CD4+，CD25+，FoxP3+, CD127-和GITR+。 此类减少T抑制因子或调节性T 细胞的试剂可选自：抗CD25抗体或化疗剂。 更特别地，本发明涉及溶瘤性腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。 本发明还涉及所述载体在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，以及治疗受试者中的癌症的方法。 此外， 本发明涉及在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的方法，以及涉及本发明的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的用途。 此外，本发明涉及在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的方法，以及涉及本发明的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的用途。
表6.对于用于Ad5/3-DM-GM_CSF治疗的患者在基线处特性的总结。 关于肿瘤标志物，对于在基线处具有升高的标志物的患者进行了评估，2/6具有标志物水平的某些降低而4/6具有标志物水平的升高（表9)。 然后，根据临床级别生产了 Ad5-D24-GM-CSF, Ad5/3-D24-GM_CSF 和 Ad 5-RGD-D24-GM-CSF并开始了对患者的治疗。
副甲状腺癌: WO2018165867A1 – 肿瘤靶向多肽、制备方法及其应用
通常它们被加入以控制ElA区域，但是此外或备选地，其它基因（例如ElB或E4)也可被调节。重组腺病毒载体中也可包括外源性的绝缘子（即对抗非特异性增强子的阻碍元件）、左I TR、天然ElA启动子或染色质蛋白。 任选地，可使用任何其它的组分或修饰但在本发明的载体中不是必须的。 本发明还包括含有本发明的核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列经本领域已知的技术与一或多种异源控制区(如启动子和/或增强子)可操作相连。
- 此外， 本发明涉及在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的方法，以及涉及本发明的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的用途。
- 这些修饰方法包括对多肽氨基末端或者羧基末端的修饰、中间氨基酸残基的替换、侧链修饰等。
- 对于荧光素酶检测，为了测试衣壳修饰对转导效力的影响，将细胞接种到两个M 孔板中，50000细胞/孔。
- 通过超声引导的肿瘤内注射施用病毒，而大约五分之一的剂量被静脉内施与。
- 如权利要求15所述的缀合物，其特征在于所述缀合物包含氨基酸序列为SEQ ID NO.13-15中之一的多肽。
本发明所要解决的技术问题为提供一种能够高效专一性识别和具有更强结合力的多肽结构，其能与肿瘤细胞表面大量过表达存在的表皮生长因子受体专一性结合，从而可被用于肿瘤细胞的标记性识别诊断，或竞争性与EGFR结合，或携带肿瘤治疗药物分子达到肿瘤细胞表面，发挥靶向性治疗作用。 表达盒被用于通过利用载体而在靶标（例如细胞）中表达转基因。 如在本申请中所用的，表述“表达盒”指包含编码cDNA或基因的核苷酸序列，以及控制和/或调节所述 cDNA或基因的表达的核苷酸序列的DNA载体或其部分。 相似的或不同的表达盒可被插入一个载体或数个不同的载体中。 在本发明优选的实施方式中，所述溶瘤性腺病毒载体包含至少一个表达盒。 在本发明优选的实施方式中，所述溶瘤性腺病毒载体仅包含一个表达盒。
副甲状腺癌: 患者さんの手記
在本发明的优选实施方式中，所述方法或用途还包括向受试者施用维拉帕米或另一种钙通道阻断剂。 “钙通道阻断剂”指一类药物和天然物质，其破坏钙通道的传导，并且其可以选自：维拉帕米、二氢吡啶类、加洛帕米、地尔硫卓、咪拉地尔、苄普地尔、氟司必林和芬地林。 在本申请优选的实施方式中，所述方法或用途还包括向受试者施用并行的放射疗法。
权利要求33的所述方法，其特征在于所述肿瘤为乳腺癌，结直肠癌，胰腺癌，头颈癌，黑色素瘤，卵巢癌，前列腺癌，非小细胞肺癌中之一。 如权利要求13所述的缀合物，其所述共价键连接包含直接共价键，肽键，酯键， 二硫键，酰胺键，酰亚胺键，磷酸二酯键，脲键，异氰酸酯键，或它们的组合。 副甲状腺癌 副甲状腺癌 本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子，本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。 实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。
副甲状腺癌: 患者様へ病気と治療
可使用任何常规的方法来将所述载体或组合物施用给受试者。 施用途径取决于组合物的制剂或形式、疾病、肿瘤的位置、患者、合并症和其它因素。 在本发明的优选实施方式中，所述施用是通过肿瘤内、肌内、动脉内、静脉内、胸膜内、囊内、腔内或腹膜注射进行的， 或者是口服施用。 在本发明中，将GM-CSF转基因置于缺失了 gpl9k/6.
①MAP30-ELBD-H2-pET28b质粒构建方案如实施例1中所述。 随后从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有MAP30-ELBD-H2-pET28b质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 ①TCS-ELBD-H2-pET28b质粒构建方案如实施例1中所述。 从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有TCS-ELBD-H2-pET28b质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 副甲状腺癌 ①EGFP-ELBD-TAT-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。
副甲状腺癌: 副甲状腺について
所述方法也可以清除被提出是发起肿瘤的细胞（“癌症干细胞”）。 对最优的病毒载体的要求包括找到特定靶细胞并在靶细胞中表达病毒基因组的有效能力。 此外，最优的载体必须在靶组织或细胞中保持是有活性的。
副甲状腺癌: 副甲状腺腫瘍の
基于他人发表的安全性结果选择了 8xl01(lVP的起始剂量。 总之，在体外，Ad5-D24-GMCSF与阳性对照具有相似的溶瘤活性，并且因此转基因的产生并没有危害病毒的溶瘤能力（图fe-c)。对于Ad5/3-DM-GM-CSF和 Ad5-RGD-D24-GM-CSF显示了相似的数据（图5d)。 可用外科手术、激素疗法、化学疗法和/或放射疗法治疗癌症，但是在许多情况下，通常表征为晚期的癌症不能用目前的疗法治愈。
副甲状腺癌: 副甲状腺がん
所述标记包括对真核细胞培养物而言的二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或新霉素抗性；以及用于大肠杆菌和其它细菌培养的四环素、卡那霉素或氨卞青霉素抗性基因。 适当宿主的代表性例子包括但不限于：细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌细胞；真菌细胞，如酵母细胞(如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞，如果蝇S2和夜蛾SF9细胞；动物细胞，如CHO,COS,NSO,293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。 本发明还包括通过合成和重组技术生产本发明的肿瘤靶向肽”或肿瘤细胞靶向性穿膜肽或含其的融合蛋白的方法。 通过本领域已知的方法可以分离和纯化多核苷酸(DNA或RNA)、载体、转化体和生物体。 本发明所述多肽，包括但不限于“肿瘤靶向肽”、“细胞穿膜肽”、“肿瘤细胞靶向性穿膜肽”，可按照常规的多肽合成技术进行固相合成或液相合成或液固相合成。 为此，本发明一方面公开了，一种肿瘤靶向多肽，其包含氨基酸序列为YXGXR所示的第一序列和氨基酸序列为YXGXR所示的另一第二序列，所述第一序列与所述第二序列之间通过连接肽链接，其中Y表示酪氨酸或其衍生物；G表示甘氨酸或其衍生物；R表示精氨酸或其衍生物；X表示含侧链带脂肪类基团或/和羟基类基团或它们组合或其衍生物的氨基酸。
副甲状腺癌: 副甲状腺機能亢進症顎腫瘍症候群（Hyperparathyroidism-jaw tumor syndrome：HPT-JT症候群）
从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-TAT-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 ①EGFP-ELBD-H2-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。 随后从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-ELBD-H2-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 ①EGFP-Tn-HBD-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌の原因
从保藏菌株的固体LB培养基平板上挑取一个转化有EGFP-ELBD-TAT-pET28a质粒的单菌落于30ml含有卡那霉素(10-50mg/L)的LB液体培养基中在37℃振荡培养至OD600约为0.5-1.0。 ③将培养温度调整到15-20℃范围内，加入适量的IPTG(0.1-10mM)诱导目标蛋白表达，继续培养10-20h，低速离心收集菌体。 ①EGFP-TAT-pET28a质粒构建方案如实施例1中所述。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌
与EGFR结合的这些配体分子，在空间结构上具有非常类似并保守的三维结构，即配体分子内部通过多肽链内二硫键的作用(Cys6–Cys20，Cys14–Cys31，Cys33–Cys42)而形成典型的三环状结构4。 Ad5基因组含有早期（E1-4)，中期（IX和IVa2)以及晚期（Ll_5)基因，侧翼是左侧和右侧的反向末端重复（分别为LITR和RITR)，所述反向末端重复含有DNA复制所需的序列。所述基因组还含有包装信号（Ψ)和主要晚期启动子（MLP)。 图8b显示了肿瘤内注射Ad5-DM_GMCSF引起了叙利亚仓鼠的血清中高水平的 hGMCSF。 在第4天对用或Ad5-DM_GMCSF处理的动物进行取样并通过FACSARRAY 评估血清中人GMCSF的浓度。 ②取此菌体培养液，以1％的接种量接入一定体积含一定浓度卡那霉素(10-50mg/L)的培养基中继续进行扩大培养，直至OD600约为0.5-1.0。 采用人工固相合成带有Bam HI和Xho I酶切位点的DNA引物，以已构建的质粒EGFP-ELBD-H2-pET28a中的ELBD-H2基因为模板进行PCR扩增，并添加酶切位点Bam HI和Xho I。
副甲状腺癌: 副甲状腺癌の再発
上述剂型中可经口服给药的剂型为：片剂、胶囊、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、醑剂。 固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸氢钙、微晶纤维素、蔗糖、白陶土、微粉硅胶、滑石粉、低取代羟丙基纤维素、羧甲基淀粉钠、聚乙烯吡咯烷酮。 而液态载体包括：无菌水、乙醇、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。 在制备药物组合物的过程中通常使用的佐剂包括：调味剂、着色剂、防腐剂(如羟苯烷基丁酯、苯甲酸钠、山梨酸)和抗氧化剂(如维生素E、维生素C、焦亚硫酸钠和二丁基羟基甲苯)。 通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法，即可将本发明的核酸和核酸重组载体导入宿主细胞。 所述方法描述于多个标准的实验室手册中，如Davis等,Basic Methods In Molecular Biology。
副甲状腺癌: 副甲状腺がんの治療(PDQ®)
为了检查肿瘤可以被基于Ad5的病毒感染，将取自组织的活体样本均质化并根据标准的感染方案用编码荧光素酶的Ad5Lucl使其感染。 简要地，用PBS将接种于孔中的细胞清洗两次，融化病毒并重悬于最少量的生长培养基中且轻轻地倒在细胞上。 感染进行了 30分钟，随后在PBS中再次清洗细胞并加入适量的完全生长培养基。 需注意仅获得了少量的组织，因此不能计算细胞的数目，也不能计算相对于组织的量校准过的病毒量。 因此，没有进行定量的分析，但是定性的数据显示了在患者012和C3 中成功的基因转移（图7a-b)。减去了背景荧光素酶的值（大约200RLU)。
图lOa-d显示Ad5-DM_GMCSF引起了抗肿瘤表位和腺病毒（存在于肿瘤细胞中） 的T细胞应答。 在用来自腺病毒5的肽混合物和来自肿瘤抗原存活素的肽混合物刺激后，通过I FN- y ELI SPOT分析了收获自以Ad5-DM_GMCSF治疗的患者的T细胞。 图8c显示了以Ad5-DM_GMCSF (而非Ad5D24)治疗HapTl肿瘤保护了叙利亚仓鼠免受随后HapTl的再攻击。