放置培養箱過夜細胞貼附後，依各組別加入對應濃度之該喹唑啉酮衍生物，放置培養箱培養72小時。 取出96孔盤後，每孔分別加入50μl之50%TCA，並於4℃靜置1小時。 每孔再加入100μl之0.4%(w/v)SRB(其溶於1%醋酸)後，靜置室溫30分鐘。 最後，每孔再加入100μl之10μM unbuffered Tris base(pH10.5)，並置於迴轉式震盪器震盪10分鐘，以ELISA reader於540nm波長偵測其OD值，利用所偵測之OD值計算細胞存活率百分比。 在之前的研究中已成功辨識並分離出CAR+/mPSCs(圖1與1)。
- 放置培養箱過夜細胞貼附後，依各組別加入對應濃度之該喹唑啉酮衍生物，放置培養箱培養72小時。
- 最後，請參閱第8圖，其係本發明之喹唑啉酮衍生物與5-氟尿嘧啶組合之實驗結果圖。
- 在一較佳具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi無限生長，且於體外從2個細胞生成腫瘤。
- 有數個增生階段其細胞逐漸累積並開始發展異常外觀，是為發育異常階段的出現。
- 這些結果指出CAR+/mPSCsOct-4_hi不僅擁有血管新生潛能，亦參與體外之管柱形成。
- 加入嘌呤黴素(purimycin，2.5μg/mL)至培養液中，五天後GFP陽性細胞株可被鑑定及放大，其稱為C1-GFP細胞株。
另外，Tie2激酶抑制劑降低內皮細胞生長培養基培養之C1細胞株的管柱形成潛能，並於雞胚胎尿絨毛膜(chick chorioallantoic membrane；CAM)試驗中抑制C1細胞株促進的血管形成(圖19)。 另外，內皮細胞生長培養基培養之C1細胞株的管柱形成在抗體中和血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A；VEGFA)組與IgG控制組中並無顯著差異(圖19)。 在異體移植腫瘤試驗中，50mg/公斤體重之Tie2抑制劑在C1細胞株移植7天後每2天經腹腔注射一次。 腫瘤形成 Tie2抑制劑顯著降低C1於腫瘤早期發展時期之腫瘤體積(圖19)。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
進行細胞計數後，以每孔2×105之該口腔鱗狀上皮癌細胞種入6孔盤中，分別為空白對照vehicle(0.4%DMSO)、5、10、20、40(μM)等5個組別。 放入培養箱中培養隔夜以利細胞貼附後，移除上清液，再以1×PBS清洗兩次並且移除後，分別依據組別加入所需的藥物(該喹唑啉酮衍生物)濃度，再放入培養箱中培養6以及12小時。 接續，為一系列對於該口腔鱗狀上皮癌細胞之存活、腫瘤形成、細胞週期狀態、凋亡以及促凋亡蛋白之表現的實驗，以確認本發明之該喹唑啉酮衍生物可抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞。 並進一步搭配5-氟尿嘧啶(5-Fu)使用，使抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞可達到更好的效果。 本發明提供一實施例，其內容在於喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係促進該口腔鱗狀上皮癌細胞之凋亡。 本發明提供一實施例，其內容在於喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該口腔癌細胞係一口腔鱗狀上皮癌細胞。
一種喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係用於抑制一口腔癌細胞，該喹唑啉酮衍生物具有如下結構式： 。 由此可證實當該口腔鱗狀上皮癌細胞中加入該喹唑啉酮衍生物作用時，隨著該喹唑啉酮衍生物之濃度增加以及加入該喹唑啉酮衍生物處理的時間增加會促進該口腔鱗狀上皮癌細胞之凋亡的現象增加。 並由第3A圖可知，3組小鼠平均體重變化百分比並未有差異，表示該喹唑啉酮衍生物在進入小鼠體內後並未有顯著毒性。 然，由第3B圖可知，加2.5mg/kg之藥(該喹唑啉酮衍生物)的組別與沒加藥(Control組)的組別相比，2.5mg/kg的組別在第14天(第7次加藥)就可觀察到腫瘤大小比起沒加藥(Control組)的組別已有明顯變小，並在第50天結束觀察時比起沒有加藥的組別小了約30%。 而，5mg/kg的組別則在第12天(第6次加藥)就可觀察到腫瘤大小與沒加藥組別相比已有明顯變小，並在第50天結束觀察時比起沒有加藥的組別小了約41.7%。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
與老鼠胚胎幹細胞株相比，CAR+/mPSCs於聚合酶連鎖反應及即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)分析中其Oct-4、Sox-2與Nanog表現量較低(圖1)。 CAR+/mPSCs於第7天表現其分化為第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)之潛能， 其證據為其扁平細胞之型態以及第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)標記T1α與AQP5(圖1)的出現。 因此，CAR+/mPSCs具有肺部專一性幹細胞/先驅細胞(stem/progenitor cell)之特性，這些細胞可利用CAR表現來辨識及利用螢光流式細胞分選儀有效分離出來。 腫瘤切片於檸檬酸鹽緩衝液(10mM，pH 6.0)中經微波輻射修復抗原，將此腫瘤切片與初級抗體於4℃下反應過夜。
這也間接發現了口腔癌與現代人之生活環境及習慣息息相關，根據統計，高達70%以上罹患口腔癌之病患具有抽菸或嚼食檳榔的習慣。 利用TRIzol試劑萃取總RNA，依照製造商的說明使用M-MLV RT合成cDNA。 即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)係利用7900HT即時聚合酶連鎖反應儀器操作，引子序列列於表1中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase；GAPDH)表現用於標準化。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
細胞裂解物在RIPA緩衝液中萃取，並利用BCA蛋白質檢測試劑依照製造商之說明定量，等量(30μg)之總蛋白以十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，並轉漬到活化的聚偏二氟乙烯膜上。 墨點與共軛辣根過氧化物酶之二級抗體孵育，並以加強之化學冷光偵測器(chemiluminescence detection，Millipore)偵測免疫反應帶(immune-reacted bands)。 腫瘤形成 腫瘤形成 本文中使用之「載體」一詞係指一核酸分子，其具有可在宿主細胞分裂之核酸序列。 該載體亦包含載體內允許核酸序列接合之核酸序列，該核酸序列亦在宿主細胞中複製。 載體之代表包含質體、黏質體或病毒載體；較佳時，該載體為反轉錄病毒載體。
癌起始細胞鑑定的不一致性可能起因於所 研究之細胞源自不同的癌細胞株或成熟腫瘤，臨床腫瘤樣本的表型或功能上的異質性可能加重癌起始細胞鑑定上的困難。 步驟如下：先將該口腔鱗狀上皮癌細胞以2×106顆種5盤在10公分細胞盤中，放入培養箱中24小時使細胞貼附。 最後，將玻片從支架中拿出放入裝有array wash buffer的盒子中，加入適量的LumiGLO及peroxidereagent以顯影，並立即於UVP BioSpectrum AC®Imaging System下拍攝影像。 其中該口腔癌細胞係一口腔鱗狀上皮癌細胞(SAS、OECM-1、CAL27、CAL27-Meta(由實驗室培養))。 又，本發明亦使用非癌細胞：人類永生化角質表皮細胞以及人類口腔纖維細胞來檢測其存活率。 如申請專利範圍第1項所述之癌起始細胞，其具有致瘤能力，其中該致瘤能力包含腫瘤形成、腫瘤再生、轉移能力或其組合。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
C1、E9與C7細胞株在二氯二胺鉑與太平洋紫杉醇處理後亦較CAR+/mPSC展現較低表現量之裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved caspase-3)與裂解凋亡蛋白酶-9(cleaved caspase-9)(圖11-ii)。 總括而言，這些結果顯示Oct-4之高量表現可以驅使CAR+/mPSCs轉型並賦予其似癌起始細胞的特性。 對CAR+/mPSCs及CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)藉由反轉錄病毒轉染使Oct-4過量表現。 表3顯示似鵝卵石之細胞群落形成的頻率，CAR+/mPSCs之轉染假控制組或CAR+/mPSCs衍生之第一型肺胞壁細胞(type-I pneumocytes)以Oct-4轉染皆無法觀察到群落形成。 端粒酶活性係利用端粒酶重複擴增(telomerase repeat amplification；TRAP)試驗測量，細胞於TRAP裂解緩衝液中均質化。 於3℃下反應30分鐘後，端粒酶延長產物經PCR於以下條件中放大：30個循環，每個循環包含94℃下30秒、60℃下30秒與72℃下45秒。
此發明更進一步包含 確定該候選藥物是否為抗癌藥，其乃根據步驟之候選藥物效能評估結果。 本發明提供一實施例，其內容在於喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物物係抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞之腫瘤形成能力。 本發明係關於一種癌起始細胞，其包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞。 本發明亦關於一種具有腫瘤的老鼠用於抗癌藥物篩選的用途，其中該腫瘤係由癌起始細胞所誘導，其中該癌起始細胞包含過量表現Oct-4之分離的克沙奇病毒及腺病毒受體陽性之老鼠肺部幹細胞/先驅細胞。 本發明之主要目的，係提供一種喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，藉由喹唑啉酮衍生物，來抑制口腔癌細胞之存活、腫瘤形成、週期能力等。 為利用免疫螢光染色C1-GFP細胞株衍生腫瘤所測得之內皮細胞抗原表現結果。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
有些C1細胞株之細胞被發現整合入SVEC4-10細胞的管柱網絡(圖14)。 腫瘤形成 C1、E9與C7細胞株在內皮細胞生長培養基培養7天以檢查管柱形成能力，亦培養CAR+/mPSCs作為控制組。 以內皮細胞生長培養基培養之C1、E9與C7細胞株展現管柱形成能力，然而以內皮細胞生長培養基培養之CAR+/mPSCs並無法觀察到此能力(圖15與)。 在內皮細胞生長培養基中，C1、E9與C7細胞株表現內皮細胞標記，包括CD31、CD105、CD34與CD144(圖16)。 這些結果指出CAR+/mPSCsOct-4_hi不僅擁有血管新生潛能，亦參與體外之管柱形成。
細胞之乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)活性係利用ALDEFLUOR試驗套組偵測，其根據製造商之說明操作。 將細胞懸浮於含有BODIPY-氨基乙醛(BODIPY-aminoacetaldehyde；BAAA)的ALDEFLUOR試驗緩衝劑於37℃下反應60分鐘。 細胞以一種乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)抑制劑(二乙基氨基苯甲酮(diethylaminobenzaldehyde；DEAB))處理並作為陰性對照組。 螢光流式細胞分選測量儀藉由綠色螢光通道( nm)用於分析細胞之乙醛脫氫脢活性。 圖16顯示以內皮細胞生長培養基培養之CAR+/mPSCsOct-4_hi表現內皮細胞的表面標記，CAR+/mPSCsOct-4_hi C1、E9、C7細胞株於內皮細胞生長培養基中培育7天，接著分析其內皮細胞專一性表面標記之表現，其包括CD31、CD105、CD34及CD144，數字表示陽性表現族群。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
放大圖像顯示某些GFP陽性細胞參與血管形成(以箭號標示)，且一部分的GFP陽性細胞亦表現CD31(以星號標示)(比例尺：100μm)。 為以流式細胞儀分析C1-GFP細胞株之分離腫瘤的CD31表現，代表內皮細胞之CD31陽性子群占所有腫瘤族群之3%，在18%的CD31陽性內皮細胞子群中發現GFP表現。 如申請專利範圍第2項所述之喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係提升該口腔鱗狀上皮癌細胞之染色體變異。 如申請專利範圍第2項所述之喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係提升該口腔鱗狀上皮癌細胞之促凋亡蛋白之表現。 如申請專利範圍第2項所述之喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞之週期。 如申請專利範圍第2項所述之喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係抑制該口腔鱗狀上皮癌細胞之存活率。
- 此外，有些內皮細胞同時表現內皮細胞抗原且為GFP陽性(圖17-i,ii與iii)。
- C1細胞株衍生球體吸收SVEC4-10細胞並建立管柱網絡(圖14)。
- 細胞以別藻藍蛋白(allophycocyanin；APC)共軛抗老鼠CD133抗體標記，接著以螢光流式細胞分選測量儀分析。
- 在一較佳具體實施例中，該CAR+/mPSCOct-4_hi具有致瘤能力，其中該致瘤能力包含腫瘤形成、腫瘤再生、轉移能力或其組合。
- 另外，C1、E9與C7細胞株能繁殖超過50代，其倍增時間為23±1小時(圖6)，在表5中顯示倍增時間。
- 本發明提供一實施例，其內容在於喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係促進該口腔鱗狀上皮癌細胞之凋亡。
- 細胞以一種乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase；ALDH)抑制劑(二乙基氨基苯甲酮(diethylaminobenzaldehyde；DEAB))處理並作為陰性對照組。
- 利用免疫螢光染色，偵測到C1-GFP細胞株衍生腫瘤中的內皮細胞抗原，包含CD31、vWF與CD105。
50mg/公斤體重之Tie2激酶抑制劑於第10至25天中每兩天經腹腔施打一次。 腫瘤大小每2或3日經卡尺測量一次，且體積(cm3；立方公分)根據下列標準算式計算：長度×寬度2/2。 在一較佳具體實施例中，該用於抗癌之候選藥物為一治療癌起始細胞之候選藥物。 腫瘤形成 在一更佳具體實施例中，該用於抗癌之候選藥物為一治療肺癌起始細胞之候選藥物。 腫瘤形成 在一具體實施例中，該抗癌藥物是一治療癌起始細胞之藥物，在一較佳具體實施例中，該抗癌藥物是一抗肺癌藥物，在一更佳實施例中，該抗癌藥物是一治療肺癌起始細胞的藥物。
腫瘤形成: 正常の好酸球数
受精雞卵在37℃及80%之濕度環境下培養，發育第8天時將1×106顆細胞放置於膜上並移植到生長中之雞胚胎尿絨毛膜上方，第11天時雞胚胎尿絨毛膜以4%三聚甲醛固定，並以立體顯微鏡及數位相機拍照，分支點以NIH Image J軟體及血管新生外掛程式定量。 細胞以不同濃度之二氯二胺鉑(cisplatin，Sigma-Aldrich)或太平洋紫杉醇處理。 48小時後根據廠商說明書指示操作WST-1試驗測定細胞存活率，細胞存活率以未處理組別之百分比表示，並得到IC50值。
為利用流式細胞儀分析C1、E9與C7細胞株中的CAR陽性之族群。 為以 免疫螢光染色呈現在C1、E9與C7細胞株之細胞膜中的CAR表現量，在Alex488nm螢光下標記CAR，DAPI為細胞核之標記，插入之圖像為正方形區域內之放大圖。 如申請專利範圍第2項所述之喹唑啉酮衍生物作為製備口腔癌藥物之用途，其中該喹唑啉酮衍生物係進一步搭配一5-氟尿嘧啶。 此方法係將microarray晶片中的抗體與加入該喹唑啉酮衍生物過後的cell lysate相互作用，以挑選與apoptosis相關路徑與蛋白(Antibody Array Kit [#12856]) 。 首先，經由皮下注射1×107之該口腔鱗狀上皮癌細胞進入小鼠(6~8週大雄性NOD/SCID(NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrlBltw)免疫不完全小鼠)體內，依體重平均分配為3組(DMSO(為Control組)、2.5mg/kg、5mg/kg)。