在一些實施例中，亦包括成人腫瘤/癌症及小兒腫瘤/癌症。 副甲狀腺荷爾蒙 根據本揭露生產之iPSC可用於生產經基因工程改造或基因轉殖之經分化細胞。 基本上，此將藉由下列方式實現：將所欲之一或多個基因引入、或移除全部或部分根據本發明生產之iPSC的一或多個內源基因，及使此類細胞分化為所欲細胞類型。
用於達到此類修飾之較佳方法係藉由同源重組，因為此技術可用於在類幹細胞基因組中之特定一或多個位點插入、缺失、或修飾一或多個基因。 本揭露的一大優勢是其提供適用於移植之同源或同基因人類細胞的基本上無限供應。 因此，其將會消除與目前移植方法相關聯之顯著問題，即經移植組織之排斥，此可能會因為宿主對移植物或移植物對宿主之排斥而發生。
當細胞在分化路徑中已進行達到一點，而在正常情況下達到該點之細胞將會持續分化成特定細胞類型或細胞類型亞群，且在正常情況下無法分化成不同細胞類型或回復為較低分化之細胞類型時，該細胞經定向。 在某些實施例中，在步驟中經轉導之γδ T細胞係於一或多個滋養層存在下培養。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含少於90%、少於80%、少於70%、少於60%、少於50%、少於45%、少於40%、少於35%、或少於30% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含少於35% γδ T細胞。
在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養12至60小時。 副甲狀腺荷爾蒙 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養12至48小時。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養12至36小時。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養12至24小時。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養8至16小時。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養4至8小時。
將理解的是，與多能性功能上相關之基因所編碼的多肽可以卵母細胞中之母體因子存在。 該基因可由胚胎之至少一些細胞表現（例如，在著床前期間之至少一部分內）且/或表現在成人之生殖細胞前體中。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養至多3天。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養約3天。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養50至80小時。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養55至75小時。
例如，可將純度提高至至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%、或100%。
在室溫下將細胞以1200 rpm離心沉降5分鐘。 將上清液丟棄，然後將細胞溫和再懸浮於含有10 µM ROCK抑制劑及100 ng/mL bFGF之2 副甲狀腺荷爾蒙 mL的StemFit Basic 2.0培養基（針對基於滋養細胞之培養）、或含有10 µM ROCK抑制劑之mTeSR培養基（無滋養細胞之培養）中。 培養基中之ROCK抑制劑將有助於防止iPSC的自發性分化並改善其在解凍時之存活性。
使用安裝於200 µL吸量管上具有加長口部的凝膠加載吸管尖使所有經分化群落選擇性地鬆脫。 將盤用2 mL的StemFit Basic2.0培養基（針對基於滋養細胞之培養）或mTeSR培養基（針對無滋養細胞之培養）洗滌，接著用真空泵將培養基吸出。 在這兩次洗滌後，將大部分鬆脫的經分化群落自盤中取出。 本發明方法適用於識別活化至少兩種內源多能性基因在體細胞中表現之基因。
用於該等方法中之體細胞進一步包含連接至第二可選擇標記之第二內源多能性基因。 副甲狀腺荷爾蒙 該等方法可經修改以選擇出表現這兩種可選擇標記之經轉染細胞，其中對第一及第二內源多能性基因之表現進行評估。 第一及第二內源多能性基因兩者之表現指示cDNA會編碼活化至少兩種內源多能性基因在體細胞中表現之基因。 因此，在一個態樣中，本文提供用於治療或預防哺乳動物之疾病或病症的方法。 在一個實施例中，該等方法係以自個體獲得體細胞開始，重編程藉由本發明之方法獲得的體細胞以獲得iPSC。
如實施例B11之方法，其中該等γδ T細胞係藉由細胞-細胞團塊富集來富集。 如實施例B1至B12中任一者之方法，其中在步驟中該等γδ T細胞之至少一部分經活化為Vγ9+ γδ T細胞。 如實施例B1至B12中任一者之方法，其中在步驟中該等γδ T細胞之至少一部分經活化為Vγ9δ2+ γδ T細胞。 如實施例B1至B14中任一者之方法，其中該一或多種重編程因子係選自由下列所組成之群組：OCT3/4、SOX2、KLF4、LIN28、及c-Myc。 如實施例B1至B15中任一者之方法，其中在步驟中經轉導之該等γδ T細胞係於一或多個滋養層存在下培養。 如實施例B16之方法，其中在步驟中經轉導之該等γδ T細胞係於單層的滋養層存在下培養。
在另一實施例中，體細胞之重編程會將體細胞轉回多潛能狀態。 副甲狀腺荷爾蒙 如本文中所使用，用語「較低分化狀態(less-differentiated state)」因而是相對用語，且包括完全去分化狀態及經部分分化狀態。 用語「蛋白質」及「多肽」在本文中可互換使用。 肽是相對短之多肽，一般長度係在約2與60個胺基酸之間。
例如，人類造血幹細胞可用於需要骨髓移植之醫學治療中。 此類程序係用於治療許多疾病，例如晚期癌症（諸如卵巢癌及白血病）以及損害免疫系統之疾病。 造血幹細胞可例如藉由下列方式獲得：將癌症或AIDS患者之成體體細胞（例如，上皮細胞或淋巴球）與除核卵母細胞（例如，牛卵母細胞）融合，如上所述獲得胚胎或類幹細胞，及在有利於分化之條件下培養此類細胞，直到獲得造血幹細胞。 此類造血細胞可用於治療包括癌症及AIDS之疾病。
在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養60至75小時。 在某些實施例中，經單離細胞群係在活化培養物中培養70至75小時。 如請求項1至26中任一項之方法，其中所生產之該等iPSC具有TRG及TRD基因座之重排基因；且其中可選地所生產之該等iPSC具有Vγ9及Vδ2基因重排。 如請求項1至8中任一項之方法，其中該經單離細胞群係在該活化培養物中培養至多13天、至多10天、至多9天、至多8天、至多7天、至多6天、至多5天、至多4天、至多3天、至多2天、或至多1天。
在室溫下將細胞以1500 rpm離心5分鐘，然後用磷酸鹽緩衝鹽水洗滌一次。 將一百萬個MEF接種於T-150 cm 2燒瓶中之40 mL的MEF培養基(DMEM + 15% FBS + 1% Pen/Strep)中，然後在37℃下在具有7.5% CO 2之加濕培養箱中培養。 為了使MEF在7.5% CO 2下生長，DMEM培養基應含有3.7 g/L碳酸氫鈉。 在培養第2天，將培養基更換為新鮮的MEF培養基。 在培養第3至3.5天，MEF細胞達到次長滿階段（大約70%長滿）。
在某些實施例中，經單離細胞群係終末分化PBMC細胞。 在某些實施例中，經單離細胞群係終末分化γδ T細胞。 在一些實施例中，經單離細胞群可係周邊血液單核細胞、周邊血液白血球、腫瘤浸潤淋巴球、或其組合。 在一些實施例中，經單離細胞群係周邊血液單核細胞。 在某些實施例中，經單離細胞群係周邊血液單核細胞。
在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至40% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至35% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含15%至35% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含25%至35% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含30%至35% γδ T細胞。 在某些實施例中，在活化培養物中培養後，經單離細胞群包含5%至30% γδ T細胞。
- 在某些實施例中，細胞係維持於培養物中1至13天。
- 圖 7C顯示代表性直方圖，其顯示在iPSC群落A、B、C、D、及E中對SSEA-4及TRA 1-60表面表現及Oct-3及Sox2胞內表現呈陽性的細胞之頻率。
- 在一替代性實施例中，用於該方法中之體細胞包含連接至內源多能性基因及在誘導性啟動子下表現為轉殖基因之額外多能性基因的可選擇標記。
- 將小瓶內容物逐滴添加至50 mL錐形管中，試管含有25 mL的StemFit Basic 2.0培養基（針對基於滋養細胞之培養）或含有10 µM ROCK抑制劑之mTeSR培養基（針對無滋養細胞之培養）。
- 舉一個例子而言，這些方法具有於治療或預防病況中的醫療應用。
- 參見Gossen et al., 2003。
在某些實施例中，在以上方法中所述之步驟中，經轉導γδ T細胞係於一或多個滋養層存在下培養。 在某些實施例中，在步驟中經轉導之γδ T細胞係於單層的滋養層存在下培養。 在某些實施例中，滋養層包含小鼠胚胎纖維母細胞。 在某些實施例中，在步驟中經轉導γδ T細胞係於有絲分裂去活化之小鼠胚胎纖維母細胞存在下培養。 在某些實施例中，在步驟中經轉導γδ T細胞係於無滋養細胞條件下培養。 在某些實施例中，在步驟中經轉導γδ T細胞係培養於iMatrix-511塗佈盤中。
如本文中所使用，用語「T淋巴球」及「T細胞」可互換使用，且係指白血球之一種主要類型，其在胸腺中完成成熟且在免疫系統中具有各種角色，包括在身體中識別特定外來抗原、及活化及去活化其他免疫細胞。 T淋巴球可係任何T淋巴球，諸如經培養T淋巴球（例如，初代T淋巴球）、或來自經培養T細胞系（例如，Jurkat、SupT1等）之T淋巴球、或獲自哺乳動物之T淋巴球。 T淋巴球可係調節T細胞，其包括nTreg（天然Treg）、iTreg（誘導性Treg）、CD8 +Treg、調節Tr1細胞、及Th3細胞。 額外類型的輔助T細胞包括諸如Th3 、Th17、Th9、或Tfh細胞之細胞。
在投予更昔洛韋後，可在任何時候選擇性地將此類細胞自患者中消除。 此負向選擇系統係描述於美國專利第5,698,446號中並以引用方式併入本文中。 如本文中所使用，「多能性誘導基因」係指其表現促成將體細胞重編程為多能狀態的基因。
將細胞沉澱物在冰上緩慢解凍10至20分鐘，然後充分再懸浮於200 µL的再懸浮溶液中。 添加20 µL的RNase A溶液，然後將混合物在室溫下培養2分鐘。 將20 µL的蛋白酶K溶液添加至樣本中，接著添加200 µL的裂解液C 。 將混合物充分漩渦震盪約15秒然後在70℃下培養10分鐘。 在所執行之基因組PCT分析中，來自群落A、B、及C之iPSC群落全都顯示TRG及TRD基因之重排。 基因重排係識別為代表Vγ9-JP及Vδ2-Jδ1或Jδ3重組之單帶，其指示這些群落帶有經重排Vγ9Vδ2-TCR基因。
代表性序列比對顯示擴增子與TRGV9及TRDV2基因序列之間的序列同源性。 〔 圖7A 〕 至 〔 圖7C 〕顯示γδ T細胞衍生之iPSC的表徵結果。 圖 7A顯示代表性瓊脂糖凝膠影像，其顯示來自A、B、及C iPSC群落之Oct3/4、Nanog、Sox2、Lin28、仙台病毒、GAPDH、TCR α及β的RT-PCR擴增子。 圖 7B顯示重疊免疫組織化學影像，其視覺化iPSC群落中對DAPI（僅藍色）、標記（Nanog/Oct 3/4/Sox2：僅紅色）、或DAPI +標記（粉紅色）呈陽性的細胞。 圖 7C顯示代表性直方圖，其顯示在iPSC群落A、B、C、D、及E中對SSEA-4及TRA 1-60表面表現及Oct-3及Sox2胞內表現呈陽性的細胞之頻率。
使用已知方法將所欲基因/突變引入ES細胞中，可將iPSC基因工程改造，並將所得之經工程改造細胞分化為所欲細胞類型，例如造血細胞、神經細胞、胰臟細胞、軟骨細胞等。 副甲狀腺荷爾蒙 在一些實施例中，本發明之經重編程體細胞係類ES細胞，因而可根據已知用於分化ES細胞之方法進行誘導以分化，從而獲得所欲細胞類型。 例如，iPSC可藉由在分化培養基中且在提供細胞分化之條件下培養此類細胞而被誘導，以分化為造血幹細胞、肌肉細胞、心肌細胞、肝細胞、軟骨細胞、上皮細胞、尿道細胞等。
候選試劑可係任何分子或超分子複合物，例如肽、小有機或無機分子、多醣、多核苷酸等，對其針對重編程細胞或促進或增強重編程細胞之能力進行測試。 候選試劑可獲自各式各樣來源，如所屬技術領域中者所理解，包括合成或天然化合物之庫。 可取得許多技術以用於隨機及定向合成各式各樣有機化合物及生物分子。